作為一項“諾獎技術(shù)”，CRISPR 改變了科學(xué)家處理基因編輯的方式，提供了前所未有的簡便和高效。

但是，CRISPR 技術(shù)并非萬無一失，仍存在一定局限性，這讓基因和細(xì)胞療法從實驗室躍升到臨床成為一個很大的挑戰(zhàn)。

先導(dǎo)型編輯(Prime editor，PE)的出現(xiàn)，可稱得上是第三代基因組編輯技術(shù)，它能更精確、更高效地糾正特定核苷酸，同時把脫靶效應(yīng)降到很低。

當(dāng)下，基因突變引起的疾病治療，特別是罕見病的治療是學(xué)界關(guān)注的熱點之一，而對于罕見病的治療依舊是個大難題。

最近，上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院馬涵慧團(tuán)隊研發(fā)出三款新型的先導(dǎo)型編輯器，可給解決上述難題帶來新曙光。

先導(dǎo)編輯器不僅能夠?qū)崿F(xiàn)所有 12 種單堿基替換、以及小片段的插入和刪除，并且具有很低的脫靶效應(yīng)。被優(yōu)化后的先導(dǎo)編輯器，是治療這些基因突變疾病的強(qiáng)有力工具。

現(xiàn)在，學(xué)界已利用這種先導(dǎo)基因編輯方式對不少疾病相關(guān)的疾病突變修復(fù)進(jìn)行深入研究，比如全身性神經(jīng)節(jié)苷脂病(即 Tay-Sachs 病，一種與神經(jīng)鞘脂代謝相關(guān)的隱性常染色體遺傳病)。具體來說是利用先導(dǎo)編輯器在 HEXA 基因中插入 4bp 的序列構(gòu)建突變模型，為后續(xù)進(jìn)行基因治療研究提供基礎(chǔ)。

通過對 PRNP 引入一個位點突變，就可以是使人類和小鼠對朊病毒病具有抵抗力，利用先導(dǎo)編輯器在細(xì)胞水平中產(chǎn)生 G127V 突變等位基因，賦予對朊病毒的抗性。由此可以預(yù)見，先導(dǎo)編輯器具備強(qiáng)有力的應(yīng)用價值。

近年來，核酸遞送載體的開發(fā)與改進(jìn)，讓基因編輯工具體上應(yīng)用成為可能，比如利用慢病毒遞送系統(tǒng)可以將先導(dǎo)編輯器引入小鼠初級皮層神經(jīng)元，為神經(jīng)退行性疾病研究與治療打下良好的基礎(chǔ)。

馬涵慧團(tuán)隊通過腺相關(guān)病毒載體、納米脂質(zhì)顆粒或其他合適的載體，將先導(dǎo)編輯器遞送到模型動物、最終給藥到病人體內(nèi)靶向不同的器官，通過基因治療的方法來解決這些難以治愈的遺傳性疾病。

改進(jìn)先導(dǎo)編輯器效率較低的問題

概括來說，此次工作主要改進(jìn)了先導(dǎo)編輯器效率低的問題。而這一切要從 2019 年說起，當(dāng)年哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院布羅德研究所的教授劉如謙(David R. Liu)實驗室開發(fā)出先導(dǎo)編輯器，實現(xiàn)了單堿基的 12 種替換，解決了單堿基基因編輯類型有限和避免旁觀者編輯(bystander editing)的技術(shù)難題。同時，先導(dǎo)編輯器還可以實現(xiàn)小片段的插入與刪除。

但是，先導(dǎo)編輯器在不同位點的基因編輯效率差別很大，絕大部分位點的編輯效率極低。

馬涵慧團(tuán)隊猜測這可能和先導(dǎo)編輯器在活細(xì)胞內(nèi)的分子動力學(xué)有關(guān)，比如先導(dǎo)編輯器的 RNA 組合 pegRNA 自身不穩(wěn)定、非正常折疊導(dǎo)致 Cas9-pegRNA 復(fù)合物組裝困難，或組裝后的 Cas9-pegRNA 復(fù)合物對 DNA 靶向功能缺陷等。

為此，馬涵慧團(tuán)隊使用其實驗室之前開發(fā)的 CRISPRainbow 成像系統(tǒng)，對先導(dǎo)編輯器的目標(biāo) DNA 靶向效率進(jìn)行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)劉如謙實驗室開發(fā)的先導(dǎo)編輯器靶向效率很低，這有可能是限制其編輯效率的原因。

接著，他們通過在 pegRNA 的 3 端添加 RNA 適配體構(gòu)建了 3’帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 sPEs (stem loop PEs)系統(tǒng)，同時在 Cas9 上連接了 RNA 適配體的結(jié)合蛋白構(gòu)建了結(jié)合型 tPEs (Tethered PEs)系統(tǒng)。

這兩種系統(tǒng)恢復(fù)了先導(dǎo)編輯器對目標(biāo) DNA 的靶向效率。研究中，該團(tuán)隊使用 sPEs 和 tPEs 對很多的基因位點的進(jìn)行嘗試，都可以提高基因編輯效率。

特別是對于一些難以編輯的位點，sPEs 和 tPEs 系統(tǒng)極大地提高了基因編輯效率。同時，他們也發(fā)現(xiàn) sPEs 和 tPEs 系統(tǒng)幾乎沒有出現(xiàn)脫靶的現(xiàn)象。

為了讓先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)更加靈活，他們又將 pegRNA 拆分為 sgRNA 和 pRNA(prime RNA)，構(gòu)建了雙分子 RNA 的 SnPEs 系統(tǒng)。

SnPEs 系統(tǒng)能夠使 Cas9 與 sgRNA 更好地組裝，同時為先導(dǎo)編輯器增添更多改造的靈活性。目前馬涵慧團(tuán)隊正在構(gòu)建誘導(dǎo)型先導(dǎo)編輯系統(tǒng)(inducible PEs，iPEs)。

基因編輯效率和特異性是其在生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的兩個關(guān)鍵因素，sPEs、tPE 效率的提高可以為其擴(kuò)大應(yīng)用范圍，進(jìn)一步開發(fā)的 iPEs 將使得基因編輯系統(tǒng)變得更加安全可控。

近日，相關(guān)論文以《利用拴系和拆分 pegRNA 提高先導(dǎo)編輯效率和靈活性》(Enhancing Prime Editing Efficiency and Flexibility with Tethered and Split pegRNAs)為題發(fā)在 Protein & Cell 上，上科大馬涵慧實驗室和華東理工大學(xué)肖嘯實驗室聯(lián)合培養(yǎng)的博士研究生馮穎、上海科技大學(xué)研究生二年級學(xué)生劉思遠(yuǎn)為共同第一作者，馬涵慧教授為通訊作者[

馬涵慧表示：“審稿人對工作給予了高度評價。不過這個領(lǐng)域競爭比較激烈，在我們投稿這篇論文過程中，博德研究所的劉如謙實驗室在《自然·生物技術(shù)》發(fā)表了類似于 sPEs 的 ePEgRNAs 系統(tǒng)的論文，麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的埃里克·桑蒂默(Erik Sontheimer)實驗室在《自然·生物技術(shù)》發(fā)表了類似于 SnPEs 的 split prime editor 論文。”

因此在多輪的審稿過程中，審稿人要求馬涵慧團(tuán)隊就自己的系統(tǒng)和劉如謙的系統(tǒng)之間編輯效率進(jìn)行詳細(xì)的比較。

他說：“我們發(fā)現(xiàn)大部分位點 sPEs 的編輯效率優(yōu)于 epegRNAs 系統(tǒng)。同時我們的 SnPEs 和埃里克·桑蒂默實驗室的 split prime editor 各有千秋，SnPEs 系統(tǒng)改造出了更多的 RNA 適配體版本，不同版本選擇對不同位點效率的提高有所不同，SnPE 提高小片段插入和缺失方面效果明顯。

也就是說我們的系統(tǒng)可以更好地構(gòu)建誘導(dǎo)型先導(dǎo)編輯系統(tǒng)(iPEs)，讓基因編輯系統(tǒng)變得更加安全可控。”

基因成像技術(shù)和基因編輯技術(shù)的完美結(jié)合

可以說，此次研究立項的根本在于治療基因型的疾病，例如基因組中序列的插入、缺失或突變。

然而，已有的基因組編輯工具都存在編輯效率和特異性不可兼得的局限性，而先導(dǎo)編輯器很好的突破了這些局限，所以才選擇了這樣一個工具。

在嘗試階段，他們一開始就發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)編輯器在絕大部分基因位點上都很難編輯，于是就從探索先導(dǎo)編輯的分子機(jī)制和先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)改造同時開展。

該團(tuán)隊推測，效率低可能和 Cas9-pegRNA 復(fù)合物的組裝和對目標(biāo) DNA 的靶向能力有關(guān)。

于是，課題組就從如何提高 Cas9-pegRNA 復(fù)合物組裝能力和 Cas9-pegRNA 復(fù)合物對 DNA 靶向能力入手。

當(dāng)時走了很多彎路，一開始和劉如謙實驗室一樣在研究 pegRNA 的穩(wěn)定性，用高通量測序和 RNA FISH 等手段分析后發(fā)現(xiàn)，完整的 pegRNA 仍然是主要產(chǎn)物。

所以，該團(tuán)隊認(rèn)為 pegRNA 的穩(wěn)定性可能不是影響先導(dǎo)編輯器效率的主要原因，后來實驗也進(jìn)一步證明了先導(dǎo)編輯系統(tǒng)的 DNA 靶向效率低才是主因。

至于 sPEs 為什么可以提高靶向效率和編輯效率仍需進(jìn)一步研究，其猜測可能和結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化有關(guān)，使得先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)的靶向效率得到恢復(fù)。

另據(jù)悉，馬涵慧團(tuán)隊前期的工作主要集中在基于 CRISPR 的 DNA 和 RNA 成像技術(shù)，活細(xì)胞中 CRISPR 系統(tǒng)分子動力學(xué)、表觀遺傳與染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)研究中，所以團(tuán)隊需要摸索出一套基因編輯的分析系統(tǒng)。

“我們也很幸運(yùn)地得到麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉朋朋老師鼎力相助，不但幫我們分析數(shù)據(jù)，還教會了同學(xué)們?nèi)绾畏治鼍庉嬓屎兔摪行?yīng)等，使得我們后續(xù)的工作進(jìn)展非常順利，目前還有多個正在進(jìn)行的基因編輯相關(guān)的課題也因此得益。”他說。

前路雖光明，任重又道遠(yuǎn)

在一開始打算做這個課題的時候，團(tuán)隊內(nèi)部并沒有基因編輯相關(guān)課題，也沒有一套完整的基因編輯相關(guān)的研究和分析系統(tǒng)，導(dǎo)致實驗結(jié)果總是不穩(wěn)定，這讓他們無法下任何實質(zhì)性結(jié)論。

為了構(gòu)建比較好的系統(tǒng)，學(xué)生們請教了很多做基因編輯的課題組，最后慢慢摸索這才構(gòu)建出一個非常適合先導(dǎo)編輯器的系統(tǒng)，為后續(xù)研究鋪平了道路，目前他們已經(jīng)有 5-6 個先導(dǎo)編輯器相關(guān)的課題在同時進(jìn)行。

馬涵慧說：“這讓我們深刻體會到一個好的系統(tǒng)對于實驗或?qū)嶒炇业闹匾浴Ｔ谖覀儤?gòu)建好系統(tǒng)之后，發(fā)現(xiàn)所有的質(zhì)粒都需要構(gòu)建。為了爭取時間，一次性做上百個克隆質(zhì)粒 DNA 就變成常有的事。雖然很辛苦，但同學(xué)們看到好的結(jié)果時都挺欣慰的。這是我們實驗室對基因編輯工具開發(fā)的初次嘗試，也希望下一個更加精彩的工作很快能和大家見面。”

此次論文發(fā)表后，課題組又基于 SnPEs 系統(tǒng)進(jìn)一步設(shè)計了誘導(dǎo)型先導(dǎo)編輯器(inducible PEs， iPEs)。其結(jié)合 RNA 適配體的蛋白與 Cas9 分開，在二者上分別連接可誘導(dǎo)結(jié)合的元件，通過藥物、紅外光照或超聲誘導(dǎo)二者結(jié)合，進(jìn)而將 pRNA 拉至編輯位點附近發(fā)揮作用。

目前，該團(tuán)隊也正在嘗試藥物、紅外光照或超聲誘導(dǎo)基因表達(dá)或蛋白相互作用，以實現(xiàn)高效、安全可控的誘導(dǎo)型先導(dǎo)編輯器。

此外，他們還打算將 sPEs 或 tPEs 系統(tǒng)通過脂質(zhì)納米粒或腺相關(guān)病毒遞送到小鼠體內(nèi)，在個體水平上進(jìn)行疾病的治療。

由于先導(dǎo)型編輯器所涉及的蛋白質(zhì)構(gòu)建體太大，因此很難通過單個腺相關(guān)病毒載體遞送全長蛋白質(zhì)復(fù)合體的過程。

因此，后續(xù)其還會優(yōu)化先導(dǎo)型編輯器復(fù)合體的大小，直到適合單個腺相關(guān)病毒載體遞送。

雖然說先導(dǎo)編輯器為許多遺傳性疾病的治療帶來了希望，然而要將其真正應(yīng)用到臨床上還為時尚早。

出于基因安全性的考慮，先導(dǎo)編輯器還要經(jīng)歷很多改造，并且需要將這種編輯器用于各種不同類型的細(xì)胞，比如與治療相關(guān)的原代細(xì)胞或者干細(xì)胞，同時需要考慮到對脫靶效應(yīng)、免疫反應(yīng)等的醫(yī)學(xué)評價。

所以在使用先導(dǎo)編輯器治療罕見疾病之前，還有很長的一段路要走。在細(xì)胞水平的嘗試只是一個起點，后續(xù)需要在模型動物中探索遞送、編輯效率、脫靶效應(yīng)、免疫反應(yīng)等各個方面的研究。

總而言之，先導(dǎo)型編輯是罕見病基因組編輯療法領(lǐng)域的一顆“新星”，如何在提供更精確的堿基編輯能力和更高的效率的同時，保證基因治療的安全性，是馬涵慧團(tuán)隊需要繼續(xù)思考和研究的問題。