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作為一項“諾獎技術”，CRISPR 改變了科學家處理基因編輯的方式，提供了前所未有的簡便和高效。

但是，CRISPR 技術并非萬無一失，仍存在一定局限性，這讓基因和細胞療法從實驗室躍升到臨床成為一個很大的挑戰。

先導型編輯(Prime editor，PE)的出現，可稱得上是第三代基因組編輯技術，它能更精確、更高效地糾正特定核苷酸，同時把脫靶效應降到很低。

當下，基因突變引起的疾病治療，特別是罕見病的治療是學界關注的熱點之一，而對于罕見病的治療依舊是個大難題。

最近，上海科技大學生命科學與技術學院馬涵慧團隊研發出三款新型的先導型編輯器，可給解決上述難題帶來新曙光。

先導編輯器不僅能夠實現所有 12 種單堿基替換、以及小片段的插入和刪除，并且具有很低的脫靶效應。被優化后的先導編輯器，是治療這些基因突變疾病的強有力工具。

現在，學界已利用這種先導基因編輯方式對不少疾病相關的疾病突變修復進行深入研究，比如全身性神經節苷脂病(即 Tay-Sachs 病，一種與神經鞘脂代謝相關的隱性常染色體遺傳病)。具體來說是利用先導編輯器在 HEXA 基因中插入 4bp 的序列構建突變模型，為后續進行基因治療研究提供基礎。

通過對 PRNP 引入一個位點突變，就可以是使人類和小鼠對朊病毒病具有抵抗力，利用先導編輯器在細胞水平中產生 G127V 突變等位基因，賦予對朊病毒的抗性。由此可以預見，先導編輯器具備強有力的應用價值。

近年來，核酸遞送載體的開發與改進，讓基因編輯工具體上應用成為可能，比如利用慢病毒遞送系統可以將先導編輯器引入小鼠初級皮層神經元，為神經退行性疾病研究與治療打下良好的基礎。

馬涵慧團隊通過腺相關病毒載體、納米脂質顆粒或其他合適的載體，將先導編輯器遞送到模型動物、最終給藥到病人體內靶向不同的器官，通過基因治療的方法來解決這些難以治愈的遺傳性疾病。

改進先導編輯器效率較低的問題

概括來說，此次工作主要改進了先導編輯器效率低的問題。而這一切要從 2019 年說起，當年哈佛大學和麻省理工學院布羅德研究所的教授劉如謙(David R. Liu)實驗室開發出先導編輯器，實現了單堿基的 12 種替換，解決了單堿基基因編輯類型有限和避免旁觀者編輯(bystander editing)的技術難題。同時，先導編輯器還可以實現小片段的插入與刪除。

但是，先導編輯器在不同位點的基因編輯效率差別很大，絕大部分位點的編輯效率極低。

馬涵慧團隊猜測這可能和先導編輯器在活細胞內的分子動力學有關，比如先導編輯器的 RNA 組合 pegRNA 自身不穩定、非正常折疊導致 Cas9-pegRNA 復合物組裝困難，或組裝后的 Cas9-pegRNA 復合物對 DNA 靶向功能缺陷等。

為此，馬涵慧團隊使用其實驗室之前開發的 CRISPRainbow 成像系統，對先導編輯器的目標 DNA 靶向效率進行測試，結果發現劉如謙實驗室開發的先導編輯器靶向效率很低，這有可能是限制其編輯效率的原因。

接著，他們通過在 pegRNA 的 3 端添加 RNA 適配體構建了 3’帶莖環結構的 sPEs (stem loop PEs)系統，同時在 Cas9 上連接了 RNA 適配體的結合蛋白構建了結合型 tPEs (Tethered PEs)系統。

這兩種系統恢復了先導編輯器對目標 DNA 的靶向效率。研究中，該團隊使用 sPEs 和 tPEs 對很多的基因位點的進行嘗試，都可以提高基因編輯效率。

特別是對于一些難以編輯的位點，sPEs 和 tPEs 系統極大地提高了基因編輯效率。同時，他們也發現 sPEs 和 tPEs 系統幾乎沒有出現脫靶的現象。

為了讓先導編輯器系統更加靈活，他們又將 pegRNA 拆分為 sgRNA 和 pRNA(prime RNA)，構建了雙分子 RNA 的 SnPEs 系統。

SnPEs 系統能夠使 Cas9 與 sgRNA 更好地組裝，同時為先導編輯器增添更多改造的靈活性。目前馬涵慧團隊正在構建誘導型先導編輯系統(inducible PEs，iPEs)。

基因編輯效率和特異性是其在生物醫學方面應用的兩個關鍵因素，sPEs、tPE 效率的提高可以為其擴大應用范圍，進一步開發的 iPEs 將使得基因編輯系統變得更加安全可控。

近日，相關論文以《利用拴系和拆分 pegRNA 提高先導編輯效率和靈活性》(Enhancing Prime Editing Efficiency and Flexibility with Tethered and Split pegRNAs)為題發在 Protein & Cell 上，上科大馬涵慧實驗室和華東理工大學肖嘯實驗室聯合培養的博士研究生馮穎、上海科技大學研究生二年級學生劉思遠為共同第一作者，馬涵慧教授為通訊作者[

馬涵慧表示：“審稿人對工作給予了高度評價。不過這個領域競爭比較激烈，在我們投稿這篇論文過程中，博德研究所的劉如謙實驗室在《自然·生物技術》發表了類似于 sPEs 的 ePEgRNAs 系統的論文，麻省大學醫學院的埃里克·桑蒂默(Erik Sontheimer)實驗室在《自然·生物技術》發表了類似于 SnPEs 的 split prime editor 論文。”

因此在多輪的審稿過程中，審稿人要求馬涵慧團隊就自己的系統和劉如謙的系統之間編輯效率進行詳細的比較。

他說：“我們發現大部分位點 sPEs 的編輯效率優于 epegRNAs 系統。同時我們的 SnPEs 和埃里克·桑蒂默實驗室的 split prime editor 各有千秋，SnPEs 系統改造出了更多的 RNA 適配體版本，不同版本選擇對不同位點效率的提高有所不同，SnPE 提高小片段插入和缺失方面效果明顯。

也就是說我們的系統可以更好地構建誘導型先導編輯系統(iPEs)，讓基因編輯系統變得更加安全可控。”

基因成像技術和基因編輯技術的完美結合

可以說，此次研究立項的根本在于治療基因型的疾病，例如基因組中序列的插入、缺失或突變。

然而，已有的基因組編輯工具都存在編輯效率和特異性不可兼得的局限性，而先導編輯器很好的突破了這些局限，所以才選擇了這樣一個工具。

在嘗試階段，他們一開始就發現先導編輯器在絕大部分基因位點上都很難編輯，于是就從探索先導編輯的分子機制和先導編輯器系統改造同時開展。

該團隊推測，效率低可能和 Cas9-pegRNA 復合物的組裝和對目標 DNA 的靶向能力有關。

于是，課題組就從如何提高 Cas9-pegRNA 復合物組裝能力和 Cas9-pegRNA 復合物對 DNA 靶向能力入手。

當時走了很多彎路，一開始和劉如謙實驗室一樣在研究 pegRNA 的穩定性，用高通量測序和 RNA FISH 等手段分析后發現，完整的 pegRNA 仍然是主要產物。

所以，該團隊認為 pegRNA 的穩定性可能不是影響先導編輯器效率的主要原因，后來實驗也進一步證明了先導編輯系統的 DNA 靶向效率低才是主因。

至于 sPEs 為什么可以提高靶向效率和編輯效率仍需進一步研究，其猜測可能和結構的動態變化有關，使得先導編輯器系統的靶向效率得到恢復。

另據悉，馬涵慧團隊前期的工作主要集中在基于 CRISPR 的 DNA 和 RNA 成像技術，活細胞中 CRISPR 系統分子動力學、表觀遺傳與染色質高級結構研究中，所以團隊需要摸索出一套基因編輯的分析系統。

“我們也很幸運地得到麻省大學醫學院劉朋朋老師鼎力相助，不但幫我們分析數據，還教會了同學們如何分析編輯效率和脫靶效應等，使得我們后續的工作進展非常順利，目前還有多個正在進行的基因編輯相關的課題也因此得益。”他說。

前路雖光明，任重又道遠

在一開始打算做這個課題的時候，團隊內部并沒有基因編輯相關課題，也沒有一套完整的基因編輯相關的研究和分析系統，導致實驗結果總是不穩定，這讓他們無法下任何實質性結論。

為了構建比較好的系統，學生們請教了很多做基因編輯的課題組，最后慢慢摸索這才構建出一個非常適合先導編輯器的系統，為后續研究鋪平了道路，目前他們已經有 5-6 個先導編輯器相關的課題在同時進行。

馬涵慧說：“這讓我們深刻體會到一個好的系統對于實驗或實驗室的重要性。在我們構建好系統之后，發現所有的質粒都需要構建。為了爭取時間，一次性做上百個克隆質粒 DNA 就變成常有的事。雖然很辛苦，但同學們看到好的結果時都挺欣慰的。這是我們實驗室對基因編輯工具開發的初次嘗試，也希望下一個更加精彩的工作很快能和大家見面。”

此次論文發表后，課題組又基于 SnPEs 系統進一步設計了誘導型先導編輯器(inducible PEs， iPEs)。其結合 RNA 適配體的蛋白與 Cas9 分開，在二者上分別連接可誘導結合的元件，通過藥物、紅外光照或超聲誘導二者結合，進而將 pRNA 拉至編輯位點附近發揮作用。

目前，該團隊也正在嘗試藥物、紅外光照或超聲誘導基因表達或蛋白相互作用，以實現高效、安全可控的誘導型先導編輯器。

此外，他們還打算將 sPEs 或 tPEs 系統通過脂質納米粒或腺相關病毒遞送到小鼠體內，在個體水平上進行疾病的治療。

由于先導型編輯器所涉及的蛋白質構建體太大，因此很難通過單個腺相關病毒載體遞送全長蛋白質復合體的過程。

因此，后續其還會優化先導型編輯器復合體的大小，直到適合單個腺相關病毒載體遞送。

雖然說先導編輯器為許多遺傳性疾病的治療帶來了希望，然而要將其真正應用到臨床上還為時尚早。

出于基因安全性的考慮，先導編輯器還要經歷很多改造，并且需要將這種編輯器用于各種不同類型的細胞，比如與治療相關的原代細胞或者干細胞，同時需要考慮到對脫靶效應、免疫反應等的醫學評價。

所以在使用先導編輯器治療罕見疾病之前，還有很長的一段路要走。在細胞水平的嘗試只是一個起點，后續需要在模型動物中探索遞送、編輯效率、脫靶效應、免疫反應等各個方面的研究。

總而言之，先導型編輯是罕見病基因組編輯療法領域的一顆“新星”，如何在提供更精確的堿基編輯能力和更高的效率的同時，保證基因治療的安全性，是馬涵慧團隊需要繼續思考和研究的問題。